신장 이식 면역검사

신장 이식 면역검사





0. 개요


MHC (Major Histocompatibility Complex) : 면역반응의 항원 인식 과정에 관여하는 분자를 생성하는 유전자와 단백을 의미하며, 특히 사람의 MHC 를 HLA 라고 한다.

신장 이식 전 시행해야 하는 면역검사로 우선 HLA typing, PRA screening, Crossmatch 를 시행한다. HLA typing 으로 공여자 및 수여자 사이 불일치 항원이 얼마나 되는지 확인하며, PRA screening 을 하여 0% 가 넘거나, Crossmatch 양성이면 DSA 를 시행한다. (Luminex) DSA 가 positive 이면 C1q binding assay 를 시행한다. DSA 의 MFI 가 moderate 또는 strong 이거나 CM 이 양성인 경우 Desensitization 을 시행하고, MFI 가 Weak 하게, CM 가 negative 로 만들고 이식 수술을 시행한다. 

정리하면 교차반응이나, DSA 혹은 C1q assay 에서 한 가지라도 양성으로 나오면 탈감작치료를 시행하고, 이때 치료 목표는 T cell CDC-AHG & FXCM 를 negative 로 바꾸는 것과, DSA (luminex) 가 weak 혹은 negative 로 바꾸고, C1q assay 를 negative 로 바꾸는 것이다.

탈감작치료로 Bortezomib 까지 사용해야 하는 경우로는 T-CDC-AHG 1:1 이상의 경우. Rituximab 및 혈장반출술을 시행 하였음에도 DSA가 감소되지 않는 경우가 있다. 

한편, high PRA (50% 이상), CM(-), DSA (-), C1q assay (-) 인 경우 Rituximab 375mg/m2 을 사용하고 나머지는 기본 이식과 같다.


...


1. HLA typing

HLA mismatch
공여자와 수여자간 HLA 불일치 항원의 개수가 많을 수록 급성거부반응 빈도가 높고 이식신의 생존율이 낮다. 
HLA mismatch 개수 : 수여자가 가지고 있지 않은 공여자의 HLA 항원의 개수가 mismatch 개수이다. (혈청형, 유전자형)


예시 >
Recipient
HLA-A Typing (DNA-SSOP)
  - HLA-A*02
  - HLA-A*33
HLA-B Typing (DNA-SSOP)
  -HLA-B*35
  -HLA-B*58
HLA-C Typing (DNA-SSOP)
  -HLA-C*03(Cw9)
  -HLA-C*03(Cw10)
HLA-DR Typing (DNA-SSOP)
  -HLA-DRB1*09
  -HLA-DRB1*13
HLA-DQ Typing (DNA-SSOP)
  -HLA-DQ*03(DQ9)
  -HLA-DQ*06

Donor
HLA-A Typing (DNA-SSOP)
  -HLA-A*33
  -HLA-A*-
HLA-B Typing (DNA-SSOP)
  -HLA-B*51
  -HLA-B*58
HLA-C Typing (DNA-SSOP)
  -HLA-C*01
  -HLA-C*03(Cw10)
HLA-DR Typing (DNA-SSOP)
  -HLA-DRB1*12
  -HLA-DRB1*13
HLA-DQ Typing (DNA-SSOP)
  -HLA-DQ*03(DQ9)
  -HLA-DQ*06




2. HLA 교차시험

감작 (Sensitization)
체내에 공여자에 대한 항체, 주로 HLA (human leukocyte antigen) 에 대한 항체가 존재한다는것을 의미한다. 감작의 원인은 수혈, 임신, 과거 이식 등이 있으며, 원인 불명일 때도 있다.

* 감작되었는지 선별 검사 : PRA (Panel reactive antibody) 검사
* 감작되었는지 확진 검사 : HLA crossmatch (교차반응검사)



HLA crossmatch (교차반응검사)

(1) CDC (complement-dependent cytotoxicity); 보체의존성세포독성
  T-cell (HLA class I 발현) 과 B-cell (HLA class I & II 발현) 을 환자 혈청과 반응, 보체를 첨가하여 세포독성반응 판정, 전통적인 방법

(2) CDC-AHG (anti-human globulin)
  CDC 에 AHG 를 추가하여 예민도를 증가시킨 방법



(3) Flow cytometric crossmatch; FCXM
  림프구와 혈청을 반응시킨 후 fluorescence-conjugated anti-human IgG 와 T세포, B세포 특이 monoclonal antibody 를 첨가하여 Flow cytometry 를 통해 분석한다. (IgG 항체만 검출되는 장점이 있다.)


감작이 되어 있을 경우 Anti HLA-Ab 가 이식 신장을 공격하여 항체 매개성 거부반응을 일으켜 기능을 소실시키기 때문. (초급성거부반응 발생이 예상)



예시 >
HLA Crossmatching (Cytotoxicity)
HLA교차시험(T-CDC)
  - T-CDC : Positive (1:1)
  - T-AHG : Positive (1:32)
HLA교차시험(B-CDC)
  -B-CDC : Positive (1:4)

HLA Crossmatching (Flowcytometry)
HLA교차시험(T-FCXM) : Positive
  -T-FCXM ratio : 1.25
HLA교차시험(B-FCXM) : Positive
  -B-FCXM ratio : 1.97

--> DS-HLA B51(+) MFI: 16178

* 탈감작치료를 하면서 MFI 값이 감소하는지 확인한다.


...


3. HLA 항체 검사


목적 : 

* PRA (Panel reactive antibody) 는 여러가지 HLA antigen 에 대한 antibody 를 가지고 있는지 확인하는 선별검사 이다. 각각의 bead 에 흔하다고 알려진 HLA antigen 이 각각 하나씩 붙어 있으며 (수십개의 림프구나 항원으로 구성된 패널을 이용) 환자의 serum 을 넣고 fluorescence 로 확인한다. %PRA 는 양성 패널수 / 전체 패널수를 의미하며, 50% 이상 for 3 months 이면 highly sensitized 로서 IVIG, Plasmapheresis, Rituximab 등으로 탈감작 치료가 필요하다.

* PRA 가 양성이면 DSA (공여자 특이항체 검사) 가 도움이 된다.


DSA 를 검사하는 방법은 여러가지가 있지만 현재까지 Luminex 방법이 가장 sensitive 하다. 이 방법은 특징적으로 강도를 알 수 있는데 이는 MFI 로 나타내며, MFI 가 10000 이상이면 Strong, 5000~10000 사이면 Moderate, 1000~5000 사이면 Weak, 1000 미만이면 negative 이다.


(1) HLA 항원에 대한 IgG 항체의 유무 측정. 양성일 경우 검출된 항체 종류를 이용하여 감작된 정도 (%PRA)를 파악 --> 교차시험에 적합한 공여자를 만날 수 있는 가능성, 장기이식 대기 시간을 예측 가능. --> %PRA 가 50~80% 이상인 경우 highly sensitized 로 해석

(2) HLA 항체 특이성을 동정하여 공여자의 HLA 항원과 반응할 수 있는 공여자 특이항체 (DSA) 유부를 판정하고, DSA 의 MFI 값으로 항체 양성과 반응성을 예측

(3) 거부반응과 관련이 적은 IgM, autoimmune antibody 등을 판정하여 교차시험의 위양성 결과를 판정한다.



종류 :

(1) PRA screening : Pooled Ag (몇 명의 개인) --> Positive/Negative

예시 >
PRA선별(Class-I) : Positive - 12/12 MFI max 16064
Anti-MICA : Positive - 1/2 MFI max 239
PRA선별(Class-ll) : Positive - 5/5 MFI max 8619

* 검사 설명 :
Multiplex bead assay를 이용한 HLA 항체 (IgG) 선별검사
pooled HLA class I 항원 (12개 bead)
pooled HLA class II 항원 (5개 bead)
pooled MICA 항원 (2개 bead)



(2) PRA identification : Several Ag (1명의 개인) --> %PRA


(3) 단일항원 동정검사 (Luminex) / C1q 보체결합 HLA 항체, 단일항원동정검사 : Single Ag (HLA 분자 1개) --> MFI, cPRA
* cPRA (Calcuated PRA) : 한국인의 HLA-A, B, DR, DQ DNA typing 결과를 이용하여 동정된 HLA class I, II 항체에 대한 항원 빈도를 산출.


예시1 >
DS-HLA 항체(SA-Class I)
HLA class I Ab : Positive
  - Strong(MFI>10000)
A32, A74, B7, B8, B13, B18, B27, B37, B38, B39, B41, B42, B44, B45, B46, B47, B48, B49, B50, B51, B52, B57, B60, B61, B62, B63, B64, B65, B67, B71, B72, B75, B76, B77, B78, B81
  - Moderate(MFI 5000-10000)
A66, B53, B59, B73
  - Weak-Moderate(MFI 3000-5000)
B55, B56, B82, Cw2
  - Weak(MFI 1000-3000)
A1, B54
Positive CREG: -
%C-PRA: 100%


DS-HLA 항체(SA-Class II)
HLA class II Ab : Positive
  - Strong(MFI>10000)
DR4
  - Moderate(MFI 5000-10000)
DR8
  - Weak-Moderate(MFI 3000-5000)
DR11
  - Weak(MFI 1000-3000)
DR13
Positive CREG: -
%C-PRA: 100%

Luminex single antigen bead assay 결과



예시2 >
C1q Binding HLA Ab (SA-ClassI)
C1q binding class I Ab : Positive
  - Strong(MFI>10000) : -
  - Moderate(MFI 5000-10000) : -
  - Weak-Moderate(MFI 3000-5000)
B13, B63
  - Weak(MFI 1000-3000)
B7, B27, B37, B41, B44, B45, B47, B48, B49, B50, B57, B60, B61, B62, B75, B76, B77, B81
Positive CREG: -

C1q Binding HLA Ab (SA-ClassII)
C1q binding class II Ab : Negative
  - Strong(MFI>10000) : -
  - Moderate(MFI 5000-10000) : -
  - Weak-Moderate(MFI 3000-5000) : -  
  - Weak(MFI 1000-3000) : -
Positive CREG: -

Luminex single antigen bead assay C1q 결과




HLA 항체 검사 시기 : 

(1) 이식 전
교차시험 : 신장이식 검사시 1차 시행, 이식 직전에 2차 시행, 감작환자는 탈감작 치료 전/후에 시행
HLA 항체검사 : 뇌사자 이식 대기자의 경우 월 1회 주기적 검사 권장, 생체이식 환자의 경우 이식 전 DS-HLA 항체 유무 검사, 양성인 경우 탈감작 치료 전/후 항체 역가 MFI 를 추적검사

(2) 이식 후
항체매개성거부반응 예측, 진단, 치료 후 추적검사 시 시행한다.
(이식 후 새로 검출되는 De novo DS-HLA 는 항체매개성 거부반응의 예측인자)
Non-HLA 항체 : MICA, tissue antigen 에 대한 항체 (Vimentin, antiotensin II receptor type I specific Ab, anti-endothelial Ab) 등이 항체 매개성 거부반응을 유발할 수 있다.


...




4. ABO 혈액형 항체 검사


ABO 혈액형 항체는 주로 IgM 이나, anti A/B IgG 항체도 검출이 되며, 특히 O형에서 주로 IgG 형태로 검출이 된다. 부적합 ABO IgG 항체의 역가가 높을수록 급성 항체 매개성 거부반응 발생확률이 높다. 일반적인 항체 정량 측정법은 hemagglutination 을 이용한 tube method 이다.

ABO 부적합 신장이식의 경우는 다음과 같다.
(1) B 또는 AB 형 공여자가 A형 수혜자에게 이식하는 경우
(2) A 또는 AB 형 공여자가 B형 수혜자에게 이식하는 경우
(3) A 또는 B 또는 AB 형 공여자가 O형 수혜자에게 이식하는 경우 

ABO 부적합 신장이식에서 전처치 후에도 Anti-A/B IgG 역가가 1:32 이하로 감소하지 않으면 이식을 연기하고 추가로 전처치를 시행한다. (1:16 이하가 치료 목표가 되며,1:32까지 허용되기도 한다.)


예시 >
Isoagglutinin titer
Anti-A IgM - 1:16
Anti-B IgM - 1:8
Anti-A IgG - 1:32
Anti-B IgG - 1:16








# 이식 전 탈감작요법


하나의 예로 수술 약 2주전 Rituximab 375mg/m2 를 투여하고, 동시에 수 차례 Plasmapheresis 시행 및 동시에 Plasmapheresis 시행 때마다 IVIG (0.2g/kg)를 투여한다. (Plasmapheresis with IVIG 투여의 횟수는 MFI strong 인 경우 대개 6~9회를 시행하고, MFI Moderate 인 경우 6~7회를 실시하게 된다.) 수술 시 Basiliximab 을 투여한다. 또한 동시에 면역억제제 3제를 투여한다.
(1) Tacrolimus 0.1mg/kg/day, (2) Prednisolone 20mg/day, (3) MMF 1.5g/day


(1) Plasmapheresis
  혈장반출술은 새로운 항체 형성 및 항체 반등을 막지는 못하므로 IVIG, Rituximab 등의 치료를 병행한다.

(2) IVIG
  단독사용시에는 고용량 2g/kg
  Plasmapheresis 와 병행할 때는 저용량 100mg/kg

(3) Rituximab
  CD20 에 대한 monoclonal antibody. B-cell 에 작용하여 apoptosis 를 일으킴.
  용량은 375mg/m2 흔히 사용하며 1회 투여시 말초 혈액의 B-cell 이 1~2일에 걸쳐 소멸, 억제효과는 1~2년 동안 유지.

(4) Bortezomib
  B-cell 의 일부는 memory cell 로 분화하여 항원이 침입시 plasma cell 로 분화하여 항체를 분비.
  plasma cell 에는 CD20 이 발현되지 않으므로, Proteosome 억제제인 Bortezomib 을 통한 요법이 개발됨.

(5) ATG (Antithymocyte globulin)
  polyclonal antibody 로서 T-cell 을 제거함. CD4+ T helper cell 에 의한 B cell 의 활성화를 억제한다.

(6) Eculizumab
  C5에 대한 monoclonal antibody 로 C5에 결합하여 C5a 와 C5b 로 분해되는 것을 억제하며, membrane attack complex 의 생성을 막는다.




# 이식 이 후 DSA monitoring

Desensitization 요법을 시행한 사람이나, DSA 양성 / 교차반응 음성인 환자는 high-risk 군으로서 DSA 를 수시로 확인해야하고, 이식 3개월 뒤에는 Protocol 신생검을 실시한다. DSA 가 있었으나, 현재는 없는 intermediate-risk 군에서는 이식 후 첫 달은 DSA 를 확인하며, 만일 DSA 가 positive 로 확인되면 신생검을 실시한다. 감작되지 않은 첫번째 신장이식 환자는 Low-risk 군인데, 이식 후 적어도 3~12개월에 한번은 DSA 를 확인해야하고, 만일 DSA 가 positive 로 확인되면 신생검을 실시한다.

DSA 를 monitoring 하고, Protocol bx. 를 하는 이유는 Subclinical AMR 이 왔는지 일찍 확인하기 위함이다. 이는 추후 이식신의 기능부전과 밀접한 연관이 있다. Chronic AMR 의심되어 Bx. 후 결과가 Subclinical Transplant  Glomerulopathy 가 확인된다면 대개 50% 의 환자들은 5년 내 투석을 시작하게 된다. 

chronic AMR 을 치료할 때 low proteinuria 인 환자보다 heavy proteinuria 가 동반된 환자의 경우 Rituximab + IVIG 치료를 시행해보아도 예후가 좋지 않았다. (이식신의 2년 생존률이 40% 미만)










끝.
2018. 7. 19 - SJH


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